330회 항산화효소 유전자(PeroxiredoxinⅡ)를 결실한 knockout mice의 개발

330회

연사 : 유 대 열 , 한국생명공학연구원

제목:  항산화효소 유전자(PeroxiredoxinⅡ)를 결실한 knockout mice의 개발

Abstract

 PRx는 활성산소화합물 (Reactive oxygen species)의 활성을 제한하는 항산화효소이다. PRx는 catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase 등과 같은 기존의 항산화효소와 달리 thioredoxin, thioredoxin reductase 그리고 NADPH에 의해 공여되는 hydrogen을 사용하여 H2O2와 alkyl hydroperoxides를 제거하는 peroxidase이다. Peroxiredoxin family는 PRx와 homology를 가진 40가지 이상의 단백질이 미생물에서 사람까지 널리 분포하고 있다.  포유동물에는 최소한 12가지의 isoform이 보고되고 있는데, 이들은 크게 6가지 유형으로 분리되고 있다. 그중 4가지는 전형적인 thioredoxin peroxidase활성을 보이는 반면, 한가지는 지금까지 알려진 어떤 전자공여체도 이용하지 않는 새로운 형태의 peroxidase임이 확인되었다. 생쥐 PRx는 조직 중에 광범위하게 분포하고 있으며, PRx의 발현은 적혈구 세포, renal tubular cells, cardiac 및 skeletal muscle cells 그리고 소뇌 purkinje cells과 같은 뇌세포 등에 특히 높은 수준으로 발현되고 있다. PRx가 뇌에서 과발현되는 부위는 hypoxia 및 ischemic injury 에 특히 민감한 것으로 알려진 부위와 일치한다. 기존의 항산화효소인 catalase는 peroxisome에 존재하고 있고, cytosol에 주로 존재하는 것으로 알려진 glutachione peroxidase는 대부분의 조직에 적은 량으로 존재하고 있는데 비해, 포유동물의 PRx 4가지는 cytosol내 총단백질의 0.2-0.4 %나 될 정도로 다량 존재하고 있다. 이처럼 PRx는 마우스 전 조직 중에 과발현되어 다량존재하고 있어 생체 내에서 중요한 역할을 담당하고 있을 것으로 생각되고 있으나 최근 PRx가 neuronal apoptosis를 지연시킨다는 in vitro 실험결과만 보고되었을 뿐, 현재까지 PRx 의 기능이 제대로 밝혀져 있지 않아 그 기능을 밝히는 것이 매우 중요하다. 본 연구에서는 이를 위해 PRx 유전자를 결실한 knockout mice를 제작하고 그 표현형을 조사하였다.

[보충자료]

1. Peroxiredoxin 유전자의 targeting vector 제작

① PRx 란?

  PRx는 활성산소화합물 (Reactive oxygen species)의 활성을 제한하는 항산화효소이다. PRx는 catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase 등과 같은 기존의 항산화효소와 달리 thioredoxin, thioredoxin reductase 그리고 NADPH에 의해 공여되는 hydrogen을 사용하여 H2O2와 alkyl hydroperoxides를 제거하는 peroxidase이다. Peroxiredoxin family는 PRx와 homology를 가진 40가지 이상의 단백질이 미생물에서 사람까지 널리 분포하고 있다.  포유동물에는 최소한 12가지의 isoform이 보고되고 있는데, 이들은 크게 6가지 유형으로 분리되고 있다. 그중 4가지는 전형적인 thioredoxin peroxidase활성을 보이는 반면, 한가지는 지금까지 알려진 어떤 전자공여체도 이용하지 않는 새로운 형태의 peroxidase임이 확인되었다.

 생쥐 PRx는 조직 중에 광범위하게 분포하고 있으며, PRx의 발현은 적혈구 세포, renal tubular cells, cardiac 및 skeletal muscle cells 그리고 소뇌 purkinje cells과 같은 뇌세포 등에 특히 높은 수준으로 발현되고 있다. PRx가 뇌에서 과발현되는 부위는 hypoxia 및 ischemic injury 에 특히 민감한 것으로 알려진 부위와 일치한다. 기존의 항산화효소인 catalase는 peroxisome에 존재하고 있고, cytosol에 주로 존재하는 것으로 알려진 glutachione peroxidase는 대부분의 조직에 적은 량으로 존재하고 있는데 비해, 포유동물의 PRx 4가지는 cytosol내 총단백질의 0.2-0.4 %나 될 정도로 다량 존재하고 있다.

   이처럼 PRx는 마우스 전 조직 중에 과발현되어 다량존재하고 있어 생체 내에서 중요한 역할을 담당하고 있을 것으로 생각되고 있으나 최근 PRx가 neuronal apoptosis를 지연시킨다는 in vitro 실험결과만 보고되었을 뿐, 현재까지 PRx 의 기능이 제대로 밝혀져 있지 않아 그 기능을 밝히는 것이 매우 중요하다.

② targeting vector 제작

생쥐의 129 품종 genomic library에서 분리해낸 PrxⅡ 유전자의 genomic clone 3A을 이용하여 targeting vector를 만들었다.   PrxⅡ  유전자는 총 6개의 exon을 가지고 있는데, 이중 exon 2에서 exon 5까지를 homologous recombination에 의해 neor expression casette으로 치환시키므로서 functional mRNA의 발현을 차단하고, G418 처리시 살아남게 하는 positive selection marker가 삽입되도록 설계하였다. 또한 2.0 kb DNA 절편의 아래쪽에 HSV-TK 유전자를 위치시켜 random integration에 대한 negative selection marker로 작용하도록 하였다.

2. ES 세포 준비 및 배양

① ES세포

  마우스의 배반포(blastocyst)의 내부세포덩어리(ICM : inner cell mass)로부터 얻은 전분화능을 지닌 배아성 간세포를 말한다. ES세포는 카이미라 마우스의 모든 조직에 기여하는 능력을 지닌 점에서 ICM세포와 유사하다. ES세포를 주의 깊게 배양하면 계대를 반복하거나 유전자변환 과정을 거쳐도 그 전분화능을 유지할 수 있다. 본 실험에서는 129 계통 마우스 유래의  J1 ES (embryonic stem, ES) 세포를 이용하여 gene targeting하였다.

②MEF 공배양

 ES 세포의 다능성을 유지하기 위해, 임신 13.5일령의 생쥐로부터 자궁을 적출하고 태아를 분리하여 제조한 MEF(mouse embryonic fibroblast)를 사용하였다. 일반 생쥐의 MEF는 neomycin 선발 과정에서 괴사되기 때문에 영양층 세포로서 사용될 수 없다. 그러나 neo 유전자를 지닌 생쥐로부터 제조한 MEF는 transfection 후 선발과정동안 괴사되지 않고 ES 세포의 성장과 증식을 계속적으로 지지할 수 있다. 본 실험에서는 neo 유전자가 1 또는 2 copy 포함되어 있는 생쥐로부터 MEF를 제조함으로써 선발과정 중 MEF 괴사로 인한 ES 세포의 질적 저하를 극복할 수 있었다. neo 유전자를 지닌 MEF는 neo 유전자가 포함되어 있는 vector로 유전자 적중된 IP3-kinase 결실 생쥐를 교배하여 얻었다.

3. transfection에 의한 gene targeting 및 gene targeted ES 세포의 선발

electroporation (EP)에 의해 targeting vector를  J1 ES 세포에 transfection시킨 다음, 24시간 배양한 후부터 72시간 (SD 1～3일)까지는 200 ㎍/㎖ G418이 첨가된 배양액에서, 그리고 SD 3～10일 동안에는 G418 200 ㎍/㎖ 및 Gancyclovior 2 μM이 첨가된 배지에서 배양하여 두 항생제에 저항성을 갖는 ES 콜로니 230개를 선발하였다.

4. gene targeted ES 세포의 선발

① genotyping

선발된 ES 세포주를 과배양 후  genomic DNA를 분리하고 PCR에 의해 genotyping을 하였다. 그 결과 230개의 클론 중 4개가 유전자 적중 클론으로 확인되었고, PCR 결과에 대한 신빙성을 조사하기 위하여 Southern blot analysis를 수행하였다.

② 핵형 분석

선발된 ES클론의 핵형을 분석하여(표 1) 온전한 핵형을 갖춘 클론을 선발하고 C57BL/6 마우스의 embryo, blastocyst에 injection하였다.

chimera mice의 생산

① 배반포의 준비

   targeted ES 클론을 C57BL/6 마우스의 blastocyst에 injection한 다음, 대리모인  ICR 마우스의 자궁에 이식함으로써 chimera 마우스를 생산하게 된다. 우량한 배반포를 충분히 얻는 것은 chimera마우스 생산에 매우 중요하다. C57BL/6 마우스는 inbred 이기 때문에 hybrid 마우스보다 배반포를 얻기가 어렵다. 고로 어떤 시기에 injection에 좋은 배반포를 가장 많이 얻을 수 있을지 실험한 결과, 표 2와 같이 10주령 이후의 마우스로부터 얻는 것이 가장 양호한 것으로 나타났다.

 2. 미세주입가능 배반포의 생산과 공란생쥐의 주령과의 관계.

Abbreviations are IB, injectable blastocyst; NIE, non-injectable embryo.

② Blastocyst injection

 Bradley 등 (1984)에 의해 처음 실행되었던 blastocyst방법(그림 1)에 의해, 선발된  J1 ES 세포를  C57BL/6 마우스의 blastocyst에 injection하였다.  

 포배강 내로 미세주입되는 ES 세포의 수는 약 10～15개 정도로서 세포막이 선명하게 관찰되는 세포만을 골라 주입하였다. 미세주입된 배반포는 위임신 유기 2.5일령의 ICR 또는 B6×ICR F1 hybrid {ICR (♀) × C57BL/6 (♂)} 암컷 마우스의 한쪽 자궁에 8～12개씩 이식하였다.

그림 1. 포배강내로 ES 세포의 미세주입. 15개의 작고 둥근 ES 세포 (A, 화살표)를 피펫에 잡은 후 (B), trophectoderm 세포사이의 junction 부위를 통하여 (C) 미세주입하였다 (D).

③ chimera마우스의 생산

   표 3 및 그림 2와 같이 Prx II 유전자가 적중된 ES 클론으로부터 생식선 이행 카이미라 마우스를 생산하였다. chimerism이 90-100%인 male chimera 마우스가 11마리 생산되었다.

 표 3. Prx II 적중된 ES 클론으로부터 생식선 이행 카이미라의 생산.

Abbreviations are A, 1-20% chimerism; B, 30-40% chimerism; C, 90-100% chimerism.

그림 2. Prx II 카이미라 마우스의 생산. 흰색 화살표로 표시된 생쥐는 약 30% 정도의 카이미리즘을 나타내고 있으며, 검은색 화살표는 거의 대부분이 ES 세포에서 기인되었음을 보여 주고 있다.

6. homozygote knockout mice의 생산

Prx II C3와 I5 클론으로부터 생산된 카이미라와 C57BL/6J와의 역교배를 통하여 agouti coat의 생식선 이행 F1이 생산되었으며(표 3, 그림 2), 이들 F1 마우스 간의 교배를 통해 분석에 이용될 Prx II homozygote, heterozygote 및 wild type의 F2 마우스를 계속적으로 생산 중에 있다. 또한 이들로부터 생산된 heterozygote 마우스를 C57BL/6J 마우스와의 계속적인 후대교배를 통해 계통고정을 실시하고 있으며, 생식선 이행능력이 가장 우수한 카이미라와 129/SvJ와의 교배를 통해 순수한 혈통의 homozygote 마우스를 생산하였다 (그림 3).

그림 3. XL-PCR 방법을 이용한 Prx II C3 생식선이행 마우스의 genotyping. 129/SvJ 마우스와 역교배되어 생산된 5마리의 마우스 중 3마리 (lane 2～4) 및 C57BL/6J 마우스와의 역교배에서 생산된 6마리 (수컷, lane 7,8; 암컷, lane 11～14)가 heterozygote인 것으로 판명되었다. M, Marker (λ/HindIII); P, Positive; N, Negative.

7. knockout mice의 표현형

  현재 분석 중에 있다.

참고문헌

1. 유대열 등 (2000)  기능성 형질전환 동물의 생산 및 산업화가술 개발 , 과기부 특정연구과제 보고서  27-37 쪽