임시 세미나 Part. 1. 백색부후균에 의한 내분비계 장애물질의 제거 Part. 2. 백색부후균의 형질전환체 구축 및 내분비…

<공개세미나>  2008년 1월 30일

연사 : 송 홍 규, 강원대학교 생명과학부

            최 형 태, 강원대학교 생화학과

제목:  Part. 1. 백색부후균에 의한 내분비계 장애물질의 제거

         Part. 2. 백색부후균의 형질전환체 구축 및 내분비계 장애물질의 생분해

Abstract

Part. 1. 백색부후균에 의한 내분비계 장애물질의 제거

YMG 배지에서 bisphenol A (BPA), alkyl phenols 및 phthalates (100 mg/l)에 대한 생분해능이 우수한 백색부후균들을 선별한 결과 BPA와 alkylphenol (Irpex lacteus: 기계충버섯), 그리고 phthalates (Pluerotus ostreatus: 느타리버섯)를 각각 12시간과 2-4일 만에 생분해하였다. BPA의 생분해능은 전분, 포도당, 질산암모늄의 첨가와 접종량을 증가시켰을 때 상승하였고 30℃, pH 6, YMG배지, 진탕배양 (150 rpm)의 조건에서 최적 생분해능을 나타냈다. Alkyl phenol과 phthalate의 모델 물질로 각각 선별된 nonyl phenol (NP), butylbenzyl phthalate (BBP)도 BPA 와 유사한 최적생분해 조건을 보였다. 선별된 균류의 균사체와 상등액의 내분비계 장애물질의 생분해능을 조사하였는데 I. lacteus와 P. ostreatus의 내분비계 장애물질 생분해는 대부분 균사체에 의해 일어났다. I. lacteus와 T. versicolor 균사체가 고정된 agar bead는 BPA (100 mg/l)를 각각 3일과 2일 만에 100% 생분해하였고 P. ostreatus가 고정된 agar block은 DMP (100 mg/l)를 5일 만에 58% 생분해할 수 있었다. Alginate에 고정된 T. versicolor는 플라스틱 가소제 공장의 산업폐수 내의 100 mg/l BPA를 8일 만에 100% 생분해하였고 P. ostreatus가 고정된 alginate bead는 10회 이상 반복적으로 첨가된 100 mg/l BBP를 지속적으로 생분해할 수 있었다. P. ostreatus가 고정된 alginate bead를 유리 column에 충진하여 DMP 용액을 순환시켜 내분비계 장애물질의 제거를 시도한 결과 50 mg/l DMP용액 250 ml에서 DMP를 7일만에 제거하였다. T. versicolor와 P. ostreatus에 의한 BPA, BBP 및 DMP의 생분해에 따라 estrognic activity도 감소하였다. I. lacteus 배양 중 유도된 MnP 는 100 mg/l의 NP를 1시간 만에 98% 분해하였다. 이 MnP를 정제하였을 때 그 분자량은 55 KDa이였으며 45℃, pH 6에서 최적효소활성을 나타냈으며 정제 MnP는 100 mg/l NP를 1 시간 만에 98% 분해하였고, 6시간만에 estrogenic activity를 90% 감소시켰다.  위의 결과들은 종합해보면 선별된 백색부후균들 (I. lacteus, P. ostreatus, T. versicolor)은 내분비계 장애물질을 제거하는 공정개발에 사용될 수 있는 균주로 활용될 수 있으며 공정개발에 alginate 같은 담체를 이용할 경우 내분비계 함유 폐수 처리에 적용가능성을 확인하였다. 그 외 일반 오폐수처리장의 미생물 담체로 사용되는 폴리프로필렌 재질에 백색부후균 균사체와 정제효소를 고정화하여 단일 폐수처리 공정을 모사한 다양한 생물반응기에 적용하여 실제 플라스틱 가소제 공장의 미처리폐수를 유입시켜 백색부후균과 정제효소에 의한 내분비계 장애물질의 제거능을 측정하였다.

Part.2. 백색부후균의 형질전환체 구축 및 내분비계 장애물질의 생분해

 백색부후균은 리그닌 분해 효소군, 즉 laccase, lignin peroxidase (Lip) 및

manganese peroxidase (Mnp)를 모두, 또는 일부 가지고 있다. 기계충버섯 (I. lacteus)은 난분해성 물질의 분해능이 우수한 백색부후균이며, 주로 Lip과 Mnp를 분비한다. 그러나 난분해성 물질의 분해에 관련된 효소인 laccase는 매우 낮은 수준으로 분비한다고 보고되었다. 이러한 기계충버섯에 대한 연구는 주로 염료 및 다양한 난분해성 물질의 분해에 관련된 효소와 분해조건에 대한 연구가 대부분이다. 우리는 아교버섯 (Phlebia tremellosa)과 구름버섯 (Trametes versicolor)이 생산하는 laccase가 내분비계 장애물질의 분해에 적극적으로 관련되었음을 확인하였고, 이를 laccase 활성이 낮은 기계충버섯에 도입하는 분자생물학적 연구를 통하여 우수한 분해균주를 확보하고자 하였다. 높은 수준의 laccase를 생산하는 기계충버섯의 형질전환체를 얻기 위하여 아교버섯의 laccase cDNA와 구름버섯의 laccase cDNA, 균류용 형질전환 벡터인 pBARGPE1을 사용하여 구축된 발현벡터인 pBARPTLAC과 pBARTVLAC를 사용하고, 제한효소 매개삽입법 (restriction enzyme mediated integration, REMI)에 의한 형질전환을 수행하였다. 기계충버섯의 염색체 내로 laccase 발현벡터의 삽입은 벡터에 존재하는 bar-gene specific

primer 와 laccase specific primer를 이용하여 PCR과 Southern blot analysis를 통해 확인하였고 RT-PCR을 통해 laccase 발현을 확인하였다. 이 형질전환체들은 다양한 내분비장애물질, 특히 bisphenol A의 분해 및 에스트로겐 활성의 감소에 우수한 효과를 나타냈으며 유전적으로도 매우 안정하므로 분해활성의 감소 없이 장기간 안정적으로 사용할 수 있기 때문에 플라스틱, 페인트 및 캔 코팅제 산업의 폐수처리에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.